Test do wykrywania substancji zabronionych przez WADA

Foto: freeimages.com

Lista substancji zakazanych przez Międzynarodową Agencję Antydopingową (World Anti-Doping Agency, WADA) wciąż rośnie, co wymusza na specjalistycznych laboratoriach ciągłe dostosowywanie swoich metod diagnostycznych. Trudnością dla laboratoriów jest ogromna różnorodność białek wchodzących w skład substancji niedozwolonych. Białka charakteryzuje stosunkowo szeroki zakres mas cząsteczkowych - od ok. 2 do12 kDa. Związki o mniejszej masie cząsteczkowej są z sukcesem analizowane poprzez zastosowanie takich procedur jak chromatografia gazowa (GC/MS) lub chromatografia cieczowa (LC/MS). W przypadku większych związków odpowiednimi metodami jest ELISA lub immunobloting. Mimo istnienia odpowiednich metod, problemem jest czasochłonność i wydajność związana z dobraniem metody do ogromnej liczby różnych białek.

Niemieccy i belgijscy naukowcy rozwiązali ten problem poprzez kombinację metody oczyszczania immunologicznego ze spektrometrią masową, a więc metod, które stosuje się np. w analizie krwi i moczu.. Przedmiotem badań nad nowym testem były hormony uwalniające (np. sermorelina, tesamorelin), syntetyczne insuliny (np. glargine i jej metabolity, lispro, aspart, glulizynowa, detemir, degludec), naturalne insuliny, syntetyczne adrenokortykotropina (ACTH), syntetyczny insulinopodobny czynnik wzrostu 1 i ludzkie czynniki wzrostu (MGF). Mocz, surowicę lub osocze zmieszano najpierw z roztworem wzorca wewnętrznego zawierającego deuterowaną insulinę, deuterowany synachten, czynnik 15N znakowanego IGF-1 i zmodyfikowany hormon uwalniający wzrostu. Mieszaninę poddano ultrafiltracji, zastępując etap ekstrakcji w fazie stałej, co umożliwiło otrzymanie czystszych próbek. W celu wyodrębnienia peptydów próbki oczyszczano immunologicznie stosując kulki magnetyczne. Ostatnim etapem procedury było zastosowanie LC/MS z jonizacją. Widma masowe były następnie skanowane w celu znalezienia unikalnych jonów dla każdego związku przy użyciu spektrometrii mas. Rezultaty badań okazały się zadowalające. Przykładowo, naturalne insuliny w płynach biologicznych można było w łatwy sposób odróżnić od insuliny lispro. Granice wykrywalności wynosiły 5-100 pg w moczu i 0,1-2 ng w osoczu i zostały uznane za odpowiednie do wykrywania substancji, które nie są dozwolone.

Nowa procedura diagnostyczna zapewnia ochronę próbki przed niszczącym działaniem podwyższonych temperatur. Czyste ekstrakty wytwarzane za pomocą ultrafiltracji, zapobiegają zjawisku blokowania w wąskim wlocie spektrometru masowego. Ponadto, nowoopracowany test zapewnia oszczędność czasu, co jest istotne w laboratoriach kontroli antydopingowej.

(pj)