Supermikroskop zbudowany na Uniwersytecie Warszawskim

Supermikroskop zbudowany na Uniwersytecie Warszawskim

Jeden z pierwszych w Polsce mikroskopów optycznych STED o bardzo wysokiej rozdzielczości zbudowała studentka Wydziału Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego. Docelowo mikroskop ma mieć rozdzielczość 60 nm.

Z powodu ograniczenia dyfrakcyjnego mikroskopy optyczne nigdy nie będą mogły rozróżniać szczegółów mniejszych od 200 nanometrów – tak sądzono jeszcze kilkanaście lat temu. W ostatnich latach naukowcom udało się pokonać to ograniczenie i zbudować przyrządy superrozdzielcze, m.in. konfokalne mikroskopy STED. Prototypowe urządzenie tego typu powstało ostatnio na Wydziale Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego (FUW), w ramach pracy magisterskiej Joanny Oracz. Od przyszłego roku nowy mikroskop będzie używany nie tylko do badań z zakresu optyki, ale również do analizy próbek biologicznych.

Istnieje wiele metod obrazowania z rozdzielczością rzędu nanometrów np. mikroskopię elektronową czy sił atomowych. Metody te wymagają odpowiedniego spreparowania próbek i umożliwiają obrazowanie wyłącznie samej powierzchni. W przypadku próbek pochodzenia biologicznego, nierzadko żywych, mikroskopia optyczna nadal jest bezkonkurencyjna. Do jej zalet należy m.in. możliwość obrazowania przestrzennej struktury próbki. Poważną wadą jest natomiast mała rozdzielczość.

Za pomocą mikroskopu optycznego można rozróżniać szczegóły nie mniejsze niż połowa długości fali świetlnej oświetlającej próbkę. Ograniczenie wynika z dyfrakcji, która uniemożliwia zogniskowanie wiązki światła do punktu. Oznacza to że gdy użyjemy źródła światła czerwonego o długości fali na przykład 635 nanometrów, w najlepszym przypadku będziemy w stanie zobaczyć szczegóły o rozmiarach około 300 nanometrów.

W standardowej fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej wiązka lasera skanuje próbkę biologiczną i lokalnie wzbudza cząsteczki barwnika, wcześniej w odpowiedni sposób wprowadzone do próbki. Po wzbudzeniu cząsteczki te zaczynają emitować światło. Jest ono przepuszczane przez filtr i rejestrowane przez detektor umieszczony za otworem konfokalnym. Rozmiar otworu powoduje, że światło z płaszczyzn poza ogniskiem obiektywu zostaje usunięte, co zwiększa kontrast obrazu. Sam barwnik dobiera się tak, aby gromadził się w badanych fragmentach żywej komórki.

W mikroskopii STED używa się dodatkowej wiązki laserowej – wygaszającej. Wiązka ma taką długość fali, że w oświetlonych nią cząsteczkach barwnika dochodzi do emisji wymuszonej. Cząsteczki, które za pomocą emisji wymuszonej pozbyły się energii, nie są już zdolne do fluorescencji i ich światło (podobnie jak światło z emisji wymuszonej) nie przedostanie się przez filtr przed detektorem i nie będą widoczne na rejestrowanym obrazie.

Istota metody STED polega na tym, że wiązka wygaszająca przypomina w przekroju obwarzanek – w środku jest wytłumiona. Jeśli tak ukształtowana wiązka zostanie odpowiednio zgrana w czasie i przestrzeni z wiązką oświetlającą, fluorescencja będzie zachodzić przede wszystkim w tym obszarze próbki, który znajduje się w centrum wiązki wygaszającej.

Do budowy mikroskopu konfokalnego z układem STED na Wydziale Fizyki UW wykorzystano komercyjnie dostępne elementy. Warto dodać, że rok temu gdy rozpoczęto pracę nad tym urządzeniem, w Polsce działał tylko jeden mikroskop typu STED, zakupiony za półtora miliona euro. Największym problemem podczas konstruowania mikroskopu okazało się zapewnienie przekrywania się obu wiązek laserowych. „Aby zaobserwować efekt STED, obie wiązki muszą być idealnie współliniowe – minimum wiązki wygaszającej musi się dokładnie pokrywać z centrum wiązki wzbudzającej”, mówi Joanna Oracz.

Prototypowy mikroskop na FUW ma rozdzielczość ok. 100 nm, ponaddwukrotnie lepszą od standardowego mikroskopu konfokalnego. Celem jest osiągnięcie rozdzielczości ok. 60 nm. Pozwoliłaby ona obserwować tak drobne szczegóły, jak kolce dendrytyczne neuronów.

Mikroskop STED na skonstruowano we współpracy z innymi jednostkami naukowymi.
Podczas prac skorzystano m.in. z doświadczeń zgromadzonych przy budowie mikroskopu konfokalnego w Centrum Laserowym Instytutu Chemii Fizycznej PAN i Wydziału Fizyki UW. Barwienie próbek do testów przeprowadzał Instytut Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego.

(pj)