Real-time PCR w diagnostyce medycznej

Warsztaty "Real-time PCR w diagnostyce medycznej"
15-16 czerwca 2009, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu

Prowadzący:
dr Marcin Hołysz, Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu
dr Tomasz Dzieciątkowski, Centralny Szpital Kliniczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny

Umiejętności jakie muszą posiadać uczestnicy warsztatów przed przystąpieniem do zajęć:
- elementarne zasady pracy w laboratorium (praca jałowa, obsługa pipet automatycznych)
- przydatna będzie znajomość podstaw PCR
- z warsztatów skorzystają również osoby, które zetknęły się już z technologią Real-time PCR (wartością będzie możliwość konsultacji trudniejszych przypadków z doświadczonymi użytkownikami różnych platform sprzętowych, praktykami w dziedzinie molekularnych technik diagnostycznych)

Umiejętności jakie nabędą uczestnicy warsztatów:
- dobór i zakup sprzętu do prowadzenia reakcji Real-time PCR
- izolacja kwasów nukleinowych z prób klinicznych na potrzeby diagnostyki opartej o Real-time PCR
- przeprowadzanie reakcji i rozwiązywanie problemów technicznych związanych z obsługą sprzętu
- analiza wyników i ich przygotowanie na potrzeby odbiorców (lekarzy, pacjentów etc.)
- rozpoznanie kontekstu klinicznego wykonywanych analiz i umiejętność doradzenia w zakresie doboru materiału do badań oraz oceny jakościowej i ilościowej wyników

Zajęcia praktyczne oparte będą o następujące reakcje, znajdujące zastosowanie w molekularnej diagnostyce medycznej:
- ilościowe badanie obecności wirusa CMV z użyciem fluorochromu SYBR Green
- ilościowe badanie obecności wirusa EBV z wykorzystaniem sond LightCycler oraz analizy krzywych topnienia produktów reakcji PCR
- zastosowanie multiplex qPCR do wykrywania obecności mutacji w genie K-RAS (diagnostyka molekularna w terapii celowanej raka jelita grubego)

ZAPRASZAMY:
diagnostów laboratoryjnych, biologów molekularnych i biotechnologów, pracowników stacji epidemiologicznych i stacji krwiodawstwa.

PROGRAM

DZIEŃ 1 (15 czerwca 2009)
10.20 Rozpoczęcie warsztatów 10 min
10.30 Wykład: Podstawy techniki Real-time PCR:
- podstawowe różnice między klasycznym PCR, Real-Time PCR a ilościowym PCR (qPCR),
- terminologia stosowana do opisu technik PCR w czasie rzeczywistym
- rodzaje sond i metod detekcji kwasów nukleinowych stosowanych w urządzeniach real-time PCR (SYBR Green, TaqMan, Molecular Beacons, Scorpions etc.)
- przegląd głównych grup zastosowań (proste pomiary ilości DNA, mierzenie poziomu ekspresji genów, wykrywanie mutacji i polimorfizmów etc.)
- ograniczenia metody Real-time PCR
dr Marcin Hołysz notka, Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu 45 min
11.15 Przedstawienie planu zajęć praktycznych (przekazanie protokołów i omówienie ćwiczeń) 15 min
11.30 Zajęcia praktyczne:
Przygotowanie matrycy do reakcji PCR, czyli izolacja DNA z próbek klinicznych 105 min
13.15 Przerwa na obiad 45 min
14.00 Zajęcia praktyczne:
Zapoznanie się z urządzeniem do prowadzenia reakcji PCR z możliwością pomiaru w czasie rzeczywistym
- zasada działania
- aplikacje
- software
30 min
14.30 Przygotowanie i przeprowadzenie reakcji:
Ilościowe badanie obecności wirusa CMV z użyciem fluorochromu SYBR Green 75 min
15.45 Przerwa na kawę 30 min
16.15 Wykład: Zastosowania techniki Real-Time PCR w diagnostyce medycznej:
- Przekazywanie próbek od pacjenta do laboratorium (specyfika przechowywania i transportu materiału przeznaczonego do izolacji DNA) - próbki śliny, krwi, zastosowanie kart typu FTA etc.
zakres czułości (uwagi praktyczne w kontekście badań diagnostycznych)
- przegląd testów opartych o Real-time PCR uwzględnionych w protokołach leczenia przyjętych w Polsce
dr Tomasz Dzieciątkowski notka, Centralny Szpital Kliniczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny 45 min
17.00 Analiza, omówienie wyników oraz sformułowanie diagnozy z reakcji:
Ilościowe badanie obecności wirusa CMV z użyciem fluorochromu SYBR Green 30 min
17.30 Zakończenie dnia

DZIEŃ 2 (16 czerwca 2009)
9.00 Rozpoczęcie warsztatów 10 min
9.10 Przygotowanie i przeprowadzenie reakcji:
Ilościowe badanie obecności wirusa EBV z wykorzystaniem sond LightCycler oraz analizy krzywych topnienia produktów reakcji PCR 60 min
10.10 Wykład: Praktyczne rady dotyczące zakupu i eksploatacji urządzeń Real-time PCR (cz. I)
- funkcje podstawowe
- funkcje zaawansowane
- certyfikaty
dr Marcin Hołysz notka, Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu 30 min
10.40 Wykład: Praktyczne rady dotyczące zakupu i eksploatacji urządzeń Real-time PCR (cz. II)
- koszty eksploatacji
- odczynniki i gotowe zestawy
- startery, czy warto projektować własne?
- kontrola jakości (kontrole dostarczane przez producentów zestawów oraz firmy zewnętrzne)
dr Tomasz Dzieciątkowski notka, Centralny Szpital Kliniczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny 30 min
11.10 Analiza, omówienie wyników oraz sformułowanie diagnozy z reakcji:
Ilościowe badanie obecności wirusa EBV z wykorzystaniem sond LightCycler oraz analizy krzywych topnienia produktów reakcji PCR 30 min
11.40 Przerwa na kawę 30 min
12.10 Przygotowanie i przeprowadzenie reakcji:
Genotypowanie pojedynczonukleotydowych zmian (SNPs) metodą High Resolution Melting (HRM) 60 min
13.10 Wykład i dyskusja:
Rozwiązywanie problemów interpretacji i opracowania wyników na potrzeby lekarzy klinicystów oraz badań epidemiologicznych
dr Tomasz Dzieciątkowski notka, Centralny Szpital Kliniczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny 40 min
13.50 Przerwa na obiad 40 min
14.30 Genotypowanie pojedynczonukleotydowych zmian (SNPs) metodą High Resolution Melting (HRM)
Zastosowania w onkologii i genetyce medycznej 30 min
15.00 Sesja "TROUBLESHOOTING", czyli wspólne rozwiązywanie problemów technicznych
- omówienie typowych problemów
- omówienie przypadków przedstawionych przez uczestników spotkania
dr Tomasz Dzieciątkowski notka, Centralny Szpital Kliniczny, Warszawski Uniwersytet Medyczny
dr Marcin Hołysz notka, Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, Uniwersytet Medyczny w Poznaniu 45 min
15.45 Zakończenie dnia