Rewolucja w obrazowaniu żywych organizmów

Rewolucja w obrazowaniu żywych organizmów

W 2004 roku pojawiły się pierwsze wzmianki o Light-Sheet Microscopy (np.: Selective Plane Illumination Microscopy ) i od tego czasu technika ta prężnie się rozwija. Porównując do mikroskopii konfokalnej, dzięki SPIM naukowcy prowadzą obserwacje procesów biologicznych w 3D z większą rozdzielczością przez dłuższe okresy czasu.

Zacznijmy od podstaw
Istnieją różne odmiany , ale łączy je to, że laser, skupiony jest na cienkiej folii, a ramię detektora, jest zorientowane prostopadle do płaszczyzny rozświetlonej przez płytkę świetlną. Zazwyczaj tylko obrazowana część próbki jest naświetlana, co pozwala optycznie podzielić próbkę i zredukować niekorzystny wpływ światła. SPIM najpowszechniej stosuje się do śledzenia rozwoju ryb- dania pręgowanego czy zarodków muszek owocówek. Jako, że technika nieustannie idzie do przodu, zastosowań także przybywa. Używa się jej coraz częściej do np.: obrazowania mózgów in vivo u małych zwierząt, diagnostyki nowotworów, sprawdzania dokładności testów toksykologicznych lub obrazowania medycznego.

Jak to wygląda „od kuchni"?
Podstawowy SPIM kosztuje ok. 50 tys. dolarów. Jednakże czas potrzebny na jego zbudowanie, zoptymalizowanie może potrwać nawet rok lub dłużej. Posługiwanie się nim wymaga wprawy, ponieważ znacznie różni się od mikroskopu konfokalnego. Natomiast ilość zgromadzonych danych przy każdym pojedynczym badaniu sięga rzędu terabajtów. To tyle, ile mikroskop konfokalny przez rok.
Zamocowanie próbki jest zupełnie różne niż w mikroskopie świetlnym. Zwłaszcza jeśli chodzi nam o obrazowanie z różnych stron lub chcemy utrzymać przy zdrowiu organizm, obrazowany przez parę dni. Dwa najpopularniejsze typy próbek, czyli zarodki muszek owocówek czy dania pręgowanego, umieszcza się w cienkiej rurce wypełnionej agarozą.

Do przechowywania danych potrzebne jest szybkie łącze internetowe. Dzięki temu, mikroskop podłącza się do serwerów. Jednak dostęp do plików mają tylko komputery o dużej mocy. Tradycyjne komputery czy laptopy temu nie podołają. By przetworzyć dane potrzeba supernowoczesnych komputerów z min. 128 GB pamięci. Przenoszenie danych może być problematyczne, dlatego trzeba wiedzieć jak zrobić backup.

Aby ograniczyć dane do przechowywania, najlepiej zmniejszyć ilości obrazów wykonanych podczas każdego badania. Inne rozwiązania to usuwanie danych po ich przetworzeniu albo ich kompresja.

Najnowsze dokonania
Dzięki różnym modyfikacjom tej metody obrazowania, naukowcy osiągają sukcesy w swoich badaniach. Najnowsze dokonania prezentujemy poniżej.

SCAPE (Swept Confocally Aligned Planar Escitation)- technika rozwijana przez Elizabeth Hillman, docent inżynierii biomedycznej i radiologii na uniwersytecie Columbia w Nowym Jorku. Ostatniego lata zaprezentowała ona uczestnikom kursu nowy mikroskop. W ramach eksperymentu studenci obrazowali żywe pijawki. Mikroskop wykonuje obrazy tak szybko, że ruchy stworzeń uchwycono bez rozmazań. Tworzona jest seria kadrów, które łączy się w film. Przykładowo mózg żywej myszy może być zobrazowany na głębokość 200-300 mikronów, czyli prawie na taką głębokość jak przy mikroskopie dwufotonowym, lecz przy mniejszej fototoksyczności. Hillman wykorzystała technikę do obserwacji larw muszek owocówek, ich ruchów, interakcji z innymi, na tle różnych zwierząt.

Lattice Light-Sheet Microscopy- rozpowszechniona przez laureata Nobla Erica Betziga i jego grupę. Wykorzystywana do obrazowania żywych komórek i zarodków przy dużych prędkościach ze znacznie niższą fototoksycznością. Ostatnio użyta przez Betziga w celu obserwacji błony przy podziale komórkowym.

meSPIM (Microenvironmental SPIM)- użyta przez Reto Fiolkę i współpracowników do zobrazowania grupy komórek nowotworowych z rozdzielczością komórkową w 3D.

MuVi-SPIM i InVi-SPIM (Multiview SPIM i Inverted Microscope SPIM)- rozwinięte przez Larsa Hufnagela i współpracowników. Charakteryzują się tym, że otrzymuje się 4 widoki, więc nie ma potrzeby obracania próbki. Natomiast InVi-SPIM zaprojektowany został do obrazowania np.: wczesnego etapu rozwoju zarodków myszy lub innych próbek, które by nie przetrwały tradycyjnego przygotowania próbek.

(AB)